Интервью Дэвида Льюиса сайту schizophreniaforum.org

SRF Interviews David Lewis—Posted 7 April 2006 Interviewed by Gabrielle Strobel

Интервью Дэвида Льюиса (David Lewis), данное сайту «Форум Исследований Шизофрении» 7 апреля 2006 года.
Интервьюер - Габриэль Стробел (Gabrielle Strobel)

В сфере нейрофизиологии еще не преодолена пропасть между уровнем системных исследований нейронной функции и уровнем молекулярно-генетических исследований, которые стали возможны с появлением мышиных моделей. Пытаясь объединить эти столь различные аналитические уровни с помощью разнообразных подходов, Дэвид Льюис уже оставил заметный след в науке. Его работа положила начало гипотезе, описывающей процесс того, как нарушения на молекулярном уровне - имеется в виду нейротрофинная передача сигналов - переходят на уровень клеточный - здесь нарушения касаются определенных типов ингибиторных префронтальных нейронов - и приводят к отклонениям в сетевых характеристиках, необходимых для функционирования рабочей памяти - а рабочая память является одним из когнитивных доменов, затрагиваемых шизофренией. И хотя здесь нет прямой связи, не говоря уж о строгом доказательстве того, что эти факты действительно объясняют часть механизма шизофрении, исследования Льюиса обрели популярность – ведь это убедительная попытка подойти к изучению болезни, сочетая современные и классические методы.

«Меня попросили рассказать немного о себе и о том, что привело меня к карьере исследователя. Несколько поколений нашей семьи поддерживали тесную связь, и я, как самый младший, на семейных сборищах часто был предоставлен сам себе, ведь остальные дети были старше. Но тетя, которая была не замужем и жила с моей бабушкой, всегда готова была проводить время со мной. Она играла для меня на укулеле и благодаря ей я считал себя лучшим в мире мастером по покеру, ведь после наших партий я всегда уносил домой больше монет, чем приносил с собой. Но несмотря на свой малый возраст я замечал, что тетя Джесси порой пропадала. Проходили недели или месяцы, и она возвращалась, заметно изменившись. Я не понимал, в чем дело, но постепенно ей становилось лучше, мы продолжали общаться, и так до очередного раза.» (цитата из речи Дэвида Льюиса на церемонии вручения приза Либера за исследования в области шизофрении. Текст взят из NARSAD Research Newsletter, том 17, выпуск 3, осень 2005 г.).

Вопрос от Форума Исследователей Шизофрении (SRF): Какой гипотезой задается направление работы вашей лаборатории? Скажите о своем представлении, хотя бы временном, о том, каковы этапы, ведущие к развитию шизофрении?

Дэвид Льюис (DL): Рассмотрим шизофрению с общих позиций, как заболевание мозга. Я опишу эту перспективу в терминах одной модели, схематическое изображение которой приведено в первой иллюстрации к моему недавнему интервью. (Lewis et al, 2005). Для начала, общий обзор и определения. Стандартный, отработанный подход к моделированию процесса болезни может послужить стратегией для изучения шизофрении. Концептуально, модель предполагает наличие комплекса причин: полигенное наследование при неблагоприятном воздействии внешней среды запускает патогенетические механизмы, и в итоге мы имеем патологическую конструкцию. Это набор отклонений, изменяющих функционирование мозга настолько, что его патофизиология в совокупности выражается внешне в свойствах, которые мы именуем клиническим синдромом. Понимание этого процесса критично с клинической точки зрения, потому что ключом к разработке рациональной терапии является знание патофизиологии. Когда мы лечим, мы пытаемся повернуть вспять функциональные нарушения в мозге, вызывающие клинический синдром. Опять же, понимание патогенеза важно для создания вторичных превентивных методов - когда мы хотим прервать цепочку, ведущую от базовых причин к появлению нарушений в мозге. Первичное предотвращение патологии маловероятно, учитывая всю сложность генетических причин болезни.

Традиционной отправной точкой в изучении болезней мозга служит корреляция клинических проявлений и патологических находок. Болезнь Альцгеймера, например, с самого начала имела подобную связь. Алоис Альцгеймер ухаживал за Августой Д., страдавшей от прогрессирующей деменции. Когда она скончалась, он обнаружил в тканях ее мозга клубочки и бляшки и связал клинические симптомы деменции с данной патологической находкой. После этого прогресс застопорился лет на 70, пока в 1980-х годах Джордж Гленнер не обнаружил в амилоидных бляшках пептид, состоящий из 14 аминокислот. Находка Гленнера положила начало поразительным исследованиям, которые длятся уже 20 лет.

Исторически, существует интересная связь шизофрении с болезнью Альцгеймера, ведь Альгеймер работал с Эмилем Крепелиным. Незадолго до открытия Альцгеймера, Крепелин сформулировал свой взгляд на деменцию прекокс как отдельное заболевание, но вывод этот был сделан исключительно на основании клинических проявлений. Он не знал ничего о корреляции клинических проявлений и патологии мозга, и даже сегодня мы не можем провести стойкую связь между этими признаками. Поэтому в основу нашей стратегии мы положили вопрос – возможно ли извлечь из многопланового шизофренического синдрома один ключевой элемент и постараться обнаружить связанную с ним патологию? (Я подчеркиваю два слова: «ключевой», то есть важнейший, и «один», то есть не единственный. Нам нужно сфокусировать усилия на специфическом аспекте клинического фенотипа, но избежать излишнего редукционизма.) Обнаружив корреляцию, можно приступить к распутыванию других аспектов болезненного процесса, снабжая информацией разработчиков новых стратегий лечения.

Такова общая картина. Двадцать лет назад я заинтересовался данными о том, что при шизофрении специфически нарушаются исполнительные процессы (executive processes), к которым относится и рабочая память, и что эти нарушения ассоциируются с дисфункцией дорсолатерального префронтального кортекса. Возник вопрос – что не в порядке в этой части мозга и что может вызывать эти нарушения. Первой приходит на ум самая простая гипотеза: в нейронных цепях или функциональной архитектуре должны быть различимые нарушения, ведущие к дисфункции исполнительных процессов и рабочей памяти.

SRF: Говоря проще, ученые делят внешнюю симптоматику на части и преследуют каждую цель по отдельности – разбивая одну большую проблему на несколько малых. Учитывая это, будет ли у нас когда либо схема, состоящая из одного-двух основных путей развития шизофрении, которые будут и объяснять ее причины, и представлять собой удобные терапевтические мишени? Или картина заболевания останется крайне запутанной с множеством различных аспектов, и ни один из них не будет доминировать?

DL: Гетерогенность шизофрении несомненна как в этиологии, так и в клинических проявлениях. У различных людей болезнь вызывается комбинацией различных причин, и клиническая картина недуга у тех, кому ставится диагноз по совокупности диагностических критериев, также различается. Но все же есть элементы относительно неизменные на всем спектре проявлений болезни, и они могут быть отражением общей глубинной дисфункции. Одним из таких элементов является нарушение когнитивных процессов, связанных с работой префронтальной коры. Это не значит, что данное нарушение свойственно всем, кто вписался в диагностические критерии, но оно встречается настолько часто, что заслуживает рассмотрения и поиска некоей общей биологической патологии, лежащей в его основе. Гипотеза, которую мы развиваем, такова: существует некий «узел» («hub») молекулярных взаимодействий или цепей, находящийся в достаточном удалении от первоначальных причин и довольно близко к клиническим проявлениям, то есть на таком оптимальном месте в цепочке, что его можно было бы выявить у большой части больных. Его мы и ищем. Факт его существования будет говорить о том, что существует набор полезных мишеней для терапевтического воздействия, если на эти мишени можно воздействовать лекарствами. Я имею в виду не окончательное исцеление, и даже не улучшение всех аспектов заболевания, но помощь значительному количеству людей.

SRF: … связанную с улучшением рабочей памяти, так?

DL: Да.

SRF: Давайте поговорим о дорсолатеральном префронтальном кортексе. Ваш сайт содержит описание трансляционной программы исследований - от функциональной анатомии и до будущих методов терапии. Пользуясь им, попробуйте по шагам описать свой подход, кратко суммируя для каждого этапа те ключевые находки, которые уже есть на данный момент. Это заложит основы понимания и даст читателю возможность обратиться к соответствующим страничкам вашего сайта за более подробной информацией. Дайте сначала набросок той архитектуры неокортекса, которая связана с вашими исследованиями. Каковы ключевые игроки?

DL: У каждого на этом поле есть свой любимый игрок, так что я обязательно кого-нибудь обижу своим выбором.

SRF: В этот час говорим только о ваших любимцах. Всех учесть мы сегодня не сможем.

DL: Хорошо. Сетевую архитектуру коры головного мозга можно рассматривать как совокупность трех типов компонентов. Во-первых, это возбуждающие пирамидальные нейроны, которые передают информацию внутри префронтальной коры и из коры в другие области мозга. Во-вторых, несколько классов ГАМК-содержащих нейронов, которые не только обеспечивают тормозной контроль над возбуждающими нейронами, но играют фундаментальную роль в синхронизации нейронной активности в префронтальной коре. Третьим компонентом являются входящие сигналы из внешних областей. Они подразделяются на две категории: возбуждающие входящие сигналы из других областей коры и из таламуса, несущие информацию в префронтальный кортекс, и модулирующие входящие сигналы, регулирующие активность префронтального кортекса. Последние используют в качестве медиаторов дофамин, норадреналин, серотонин и ацетилхолин.

Каждая из этих трех составных частей критически необходима для нормального функционирования префронтальной коры; нельзя ставить вопрос о том, какая из них важнее.

Свидетельства о нарушениях существуют для каждой из перечисленных частей. Критическим для нас является следующий вопрос: существует ли компонент сетевой архитектуры, для которого эти свидетельства основательны и последовательны, и нарушение работы которого убедительно ассоциируется с префронтально-обусловленной когнитивной дисфункцией, наблюдаемой при заболевании?

SRF: Что привело к такому подходу?

DL: Приверженцем этого метода изучения я стал в середине восьмидесятых. Завершив только что клиническую подготовку, я хотел перейти от клинических исследований, которыми тогда занимался, к изучению шизофрении с «более нейробиологической» стороны, но не был уверен, как подойти к этому вопросу. Я услышал речь Дэнни Вайнбергера (Danny Weinberger) на встрече в Американском Колледже Нейропсихофармакологии. Он приводил свидетельства дисфункции префронтальной коры при шизофрении, выявляемой при выполнении когнитивных задач. На другой сессии, покойная ныне Патриция Голдман-Ракич (Patricia Goldman-Rakic) говорила о критической роли допамина в работе префронтальной коры. Эти два выступления пробудили во мне желание понять, как именно выстроен префронтальный кортекс у приматов, ведь его архитектура служит основой для осуществления тех процессов, которые нарушены при шизофрении. По совету и под руководством Флойда Блума, Джона Моррисона, и Стива Фута, а позже Дженни Лунд (Floyd Bloom, John Morrison, Steve Foote, Jenny Lund) я посвятил оставшееся время обучения и, позднее, первые годы работы на факультете, исключительно исследованиям префронтального кортекса животных-приматов, выявляя главные факторы и их связь друг с другом. Этим же занимались многие другие исследователи. Я лишь вносил свою лепту в первоначальную базу исследований, которая впоследствии, при появлении у нас возможности исследовать посмертные образцы человеческого мозга, обеспечила бы легкую идентификацию ключевых систем и способность интерпретировать их нарушения при шизофрении.

SRF: Вторая страница вашего сайта посвящена развитию кортекса. Там представлена интересная история о развитии в детский и юношеский период различных структур мозга. Мы еще не представили их – это нейроны-канделябры, их аксональные картриджи, парвальбуминовые варикозы (parvalbumin varicosities) и т.д. Можете кратко рассказать нам о них?

DL: В литературе, посвященной шизофрении, развивалась мысль о том, что в переходном возрасте должны запускаться некие критические процессы, вызывающие клинические симптомы болезни. Робин Мюррей и Вайнбергер принадлежали к числу ученых, считавших, что типичная для шизофрении манифестация в пубертатный период – одна из черт болезни, причину которой необходимо раскрыть. Ирвин Файнберг в одной своей работе (Feinberg, 1982) приводил аргументы в пользу того, что происходящие в юношеский период изменения мозга могут играть ключевую роль в появлении шизофрении. Существовало два взгляда на проблему. Согласно одному из них, осуществляемая в юношестве тонкая подстройка сетей мозга дает сбой и приводит к шизофрении; согласно другому, происходящие в переходный период процессы лишь обнажают другие нарушения, возникшие во внутриматочном или перинатальном периоде, либо унаследованные генетически. Несмотря на различный подход, приверженцы обоих взглядов сходились на том, что исследование специфики процессов подстройки структур мозга могло бы дать информацию о том, какие именно элементы нарушаются при заболевании. Поэтому мы, продолжая строить карту сетей, существующих в коре мозга взрослых приматов, начали серию исследований для определения того, как меняются сети мозга в пубертатный период. Мы обнаружили несколько интересных изменений в допаминергической иннервации, а также в процессе сокращения количества возбуждающих входов в пирамидальные клетки. Но нас по-настоящему поразили отчетливые изменения распределения различных маркеров клеток-канделябров, и в особенности масштаб этих изменений в пубертатный период, а также скоординированная подстройка (refinement) различных маркеров в образуемых ими синаптических соединениях с пирамидальными клетками.

SRF: Клетки-канделябры – особенный тип клеток. Перед тем, как говорить об изменениях, опишите эти клетки.

DL: Нейроны-канделябры названы так за характерную форму своих аксональных ответвлений. Этот подтип ГАМКергических нейронов коры головного мозга образует входящие синаптические соединения исключительно с начальными сегментами аксонов пирамидальных клеток, рядом с местом генерации потенциала действия. Только клетки-канделябры имеют входной доступ к этому участку, следовательно, они могут осуществлять контроль над выходным сигналом пирамидальных нейронов. Данные, полученные in vivo, показывают, что клетки-канделябры представляют собой тип вето-клетки: они способны предотвращать генерацию импульса пирамидальными нейронами (Klausberger et al., 2003), хотя недавнее in vitro исследование говорит о том, что в некоторых условиях их ГАМКергическое воздействие может быть возбуждающим (Szabadics et al., 2006; see SRF related news story and comment on Szabadics et al., 2006).

SRF: Какие изменения вы наблюдали?

DL: С пресинаптической стороны мы наблюдали снижение уровней двух белков: парвальбумина и GAT1 - протеина, обеспечивающего мембранный транспорт ГАМК. Оба белка вносят вклад в регулировку ГАМКергической нейропередачи. На постсинаптической стороне, мы заметили изменение количества одной субъединицы рецептора ГАМК(А), селективно располагающегося на начальных сегментах аксонов пирамидальных клеток – зоне, получающей входящие сигналы от клеток-канделябров.

SRF: Уровни этих двух пресинаптических маркеров, а также рецептора, резко падают незадолго до периода, который у обезьян соответствует нашему пубертатному периоду. Каково физиологическое значение этого явления? С первого взгляда кажется, что снижение входящей тормозной ГАМКергической нейропередачи в пирамидальные нейроны – нормальное явление при переходе тинэйджера в пубертатный возраст, не так ли? Как этот процесс связан с шизофренией?

DL: Мы все еще работаем над разъяснением функционального значения этих изменений. Наши находки отчетливо говорят о различной природе тормозного контролирующего воздействия на инициальный сегмент аксона в пре- и постпубертатный периоды. Мы можем сделать выводы из того, что мы знаем о функциях молекул, участвующих в этом процессе.

Например, парвальбумин задерживает внутритерминальный кальций, выполняя роль оттока. Белок медленно связывается с кальцием, находящимся в терминали аксона. Обычно в промежутках между аксональными разрядами в терминали остается некоторое количество кальция, и в случае быстрой серии разрядов происходит суммация так называемых кальциевых транзиентов. Накопление кальция усиливает выброс нейромедиаторов, так как выброс зависит от количества кальция в аксональных терминалях. Следовательно, снижая уровень парвальбумина, вы деактивируете кальциевую ловушку, и это позволяет транзиентам суммироваться и увеличивать выброс ГАМК тогда, когда разряды идут сериями. Если рассмотреть изменение уровня парвальбумина в отрыве от других изменений, мы можем сделать вывод, что тормозной контроль над пирамидальными клетками, осуществляемый через начальные сегменты их аксонов, в пубертатном периоде укрепляется, потому что серии разрядов будут усиливать высвобождение ГАМК. Именно так и происходит у нокаутной по парвальбумину мыши – выброс ГАМК усиливается.

Снижение уровня транспортера GAT1 интересно рассмотреть в свете исследований Гари Вестбрука (Gary Westbrook). Он показал, что блокировка транспортеров ГАМК имеет слабый эффект на постсинаптические тормозные потоки – но это в случае с одиночными импульсами. Когда импульсы идут плотными синхронными сериями и высвобождают медиатор одновременно, блокировка транспортера увеличивает продолжительность тормозных постсинаптических потоков. Именно так и происходит в синапсах, образуемых клетками-канделябрами. Так что изменения в уровнях как парвальбумина, так и транспортера ГАМК предположительно приводят к усилению тормозного контроля. А на постсинаптической стороне изменения можно интерпретировать с точностью до наоборот.

SRF: Количество рецепторов ГАМК(А) резко падает.

DL: Да, по крайней мере снижается количество детектируемых нами рецепторов, содержащих субъединицу альфа-2. Вместе с коллегой Джильермо Гонсалес-Бургос (Guillermo Gonzalez-Burgos) мы сейчас используем живые срезы префронтального кортекса обезьян in vitro в попытке понять, какие именно возрастные изменения происходят в этих синапсах на физиологическом уровне. Наш базовый вопрос таков: если простимулировать клетку-канделябр, воздействующую на пирамидальную клетку, и записать показатели этой пирамидальной клетки, какая разница обнаружится между образцами, взятыми у 15-месячной и 45-месячной обезьяны? (Я описываю идеальный эксперимент; в реальности мы используем не столь прямолинейную, но более практичную стратегию). У нас есть методы воздействия на транспортер и постсинаптический рецептор, и мы используем их в попытке оценить вклад вызванных изменений. На данный момент мы можем сказать, что в нормально протекающем пубертатном периоде тормозной контроль в исследуемых нами синапсах претерпевает действительно интересные изменения, но последствия этих изменений еще предстоит выяснить. Наша гипотеза заключается в том, что в сумме эти изменения позволяют клеткам-канделябрам более уверенно дирижировать синхронными разрядами пирамидальных клеток. (Our hypothesis is that the net effect of those changes is to enhance the ability of these chandelier cells to entrain populations of pyramidal cells to fire together.)

SRF: И как, по вашему мнению, этот процесс отличается у подростков с развивающейся шизофренией? Говорит ли совокупность ваших наблюдений в пользу того, что изменения сетевой структуры ведут к шизофрении, или же эти изменения обнажают уже имеющиеся нарушения?

DL: Очень трудно провести эксперимент, который мог бы напрямую ответить на эти вопросы. При исследовании посмертных образцов человеческого мозга перед нами встает серьезная проблема. Если вы держите в руках мозг 20-, 30-, 40-летнего пациента, как вы определите, что случилось с ним в подростковом возрасте? В своих догадках я склоняюсь к тому, что у многих пациентов имеют место оба нарушения, то есть данные нейронные связи имеют изначальные генетически-обусловленные отклонения, и вследствие этого траектория их развития в пубертатный период меняется. Возможно, этому способствуют некоторые внешние факторы, характерные для данного возраста, вроде курения конопли. Мы надеемся, что когда-нибудь сможем проверить последнее на обезьянах.

SRF: Мы коснулись темы клеток-канделябров и их синаптических связей с пирамидальными клетками. Что еще вы обнаружили в своих исследованиях молекулярных цепочек?

DL: Посмертные исследования были начаты по трем направлениям. Первое – определение природы ГАМКергических нарушений, оно проводится совместно с моим коллегой Таканори Хашимото. Второе – определение природы нарушений в возбудительных пирамидальных клетках. За третьим направлением не стоит никакой гипотезы, оно проводится Кароем Мирникс (Karoly Mirnics), Пэт Левит и мной с использованием технологии микроматриц для сбора фактов о болезни. Мы надеемся, что в итоге все три направления сольются в одно, но на данном этапе они идут параллельно и порождают разные идеи и гипотезы. И мы следуем им не потому, что они соответствуют трем различным типам шизофрении, а потому, что они позволяют рассмотреть нарушение системы с разных перспектив.

SRF: Расскажите о наиболее важных достижениях по каждому из этих трех направлений – по ГАМКергическим связям, по возбудительным входящим соединениям и в исследованиях с использованием микроматриц.

DL: ГАМКергические нарушения отмечены в одном подтипе клеток, в то время как большая часть ГАМКергических нейронов выглядят относительно нормально. Нейроны с нарушениями принадлежат к одному типу - это клетки-канделябры. Мы попытались увязать нарушения сетей, формируемых этими клетками, с клинически измеряемыми на ЭЭГ нарушениями синхронной активности, возникающими при выполнении больными задач, нагружающих рабочую память.

SRF: Интересно. Можно поподробнее?

DL: Конечно. Для ГАМКергических нейронов разных подклассов характерно образование взаимосвязей с членами своего же подкласса (за некоторыми исключениями). Существует как минимум пять различных классов ГАМК-нейронов, и нейроны каждого класса соединяются друг с другом посредством как химических, так и электрических синапсов, в некоторых случаях – только посредством электрических. Эти сети нейронов, судя по всему, способны к осцилляции на различных частотах. И эти частоты, вероятно, ассоциированы с различными качествами сети, необходимыми для определенных типов процессов. В случае с парвальбумин-содержащими быстроразрядными нейронами (в число которых входят клетки-канделябры), это осцилляторное поведение лежит в полосе гамма-частот – от 40 до 80 герц. Другие популяции ГАМК-нейронов осциллируют на других частотах.

При попытке связать нарушения в парвальбуминовых нейронах с функциональными нарушениями при шизофрении важно отметить две вещи. Во-первых, исследования Марка Говарда (Mark Howard) и коллег (Howard et. al., 2003) показали, что уровень гамма-активности в префронтальном кортексе повышается пропорционально степени нагрузки рабочей памяти. Гамма-активность остается высокой, пока информация удерживается в рабочей памяти, и падает, как только информация была использована. Если рассматривать рабочую память как способность собрать некоторое количество информации, задержать информацию в уме, затем использовать ее и избавиться от нее, освобождая место для следующего набора данных, то гамма-активность напрямую сопровождает этот процесс. Индикатор активности идет вверх по мере набора информации, остается на высоте при ее поддержании, и падает сразу после ее использования. Это говорит о возможной связи поведения, привычного для быстроразрядных парвальбуминовых нейронов, и эмерджентного физиологического свойства, связанного с рабочей памятью.

Во-вторых, исследования показывают, что у больных шизофренией при выполнении задач на использование рабочей памяти гамма-ритм имеет сниженную частоту. Учитывая эти два наблюдения, можно предположить, что нарушения работы быстроразрядных нейронов лежат в основе нарушений волновой активности, которые, в свою очередь, ведут к нарушениям рабочей памяти.

SRF: Обратимся теперь к патогенетической стороне вашего подхода. Мы подходим к вопросу о глубинной молекулярной причине нарушений ГАМКергической передачи сигналов в клетках-канделябрах. Что вы обнаружили?

DL: Нужно понимать, что любое нарушение мозга можно отнести к одной из четырех категорий. Оно может быть причиной болезни, может быть следствием, может быть компенсаторной реакцией или же побочным эффектом терапии, не связанным с процессом болезни. Поэтому мы задались вопросом: к какой из этих «четырех К» отнести нарушения ГАМКергической активности?

Подкрепить идею о том, что ГАМКергические нарушения действительно лежат в основе патофизиологии и вносят вклад в клинический синдром болезни, могли бы свидетельства неких соседствующих процессов – патогенетических механизмов – дающих толчок нарушениям ГАМКергической системы. При болезни мы часто наблюдаем одновременные процессы, но обычно не можем отделить причину от следствия. Поэтому мы осуществили поиск изменений, связанных с ГАМКергическими нарушениями, и попытались создать удобную для исследований модель, которая позволяла бы установить, есть ли причинно-следственная связь в наблюдаемой нами корреляции. В нашем случае, имелись свидетельства того, что для развития и поддержания маркеров ГАМКергического функционирования важна нейротрофинная передача сигналов, опосредованная воздействием молекулы BDNF на её рецептор - TrkB. Это верно в особенности для того подкласса ГАМКергических нейронов, у которых при шизофрении наблюдаются изменения, но не для подкласса, который выглядит нормальным. Если быть более конкретным, то изменения экспрессии GAD67 (глутаматдекарбоксилазы - фермента, необходимого для синтеза ГАМК) и парвальбумина демонстрировали сильную корреляцию со снижением экспрессии TrkB у больных шизофренией, но такая корреляция отсутствовала для калретинин-позитивных ГАМКергических нейронов, не измененных при шизофрении. Этот факт позволил заметить разницу между затронутой и не затронутой популяциями нейронов, в нашем случае – парвальбумин-содержащих и калретинин-содержащих.

Мы обратились к генетически модифицированной мышиной модели со сниженной экпрессией TrkB для ответа на вопрос, обнаружатся ли у нее изменения ГАМКергической системы, подобные изменениям у больных шизофренией (Hashimoto et al., 2005). Они обнаружились, таким образом, подтвердилась концептуальная модель, в которой снижение сигнала, получаемого рецептором TrkB, является причиной снижения GAD67 в определенном типе нейронов, что наблюдается при шизофрении.

SRF: Сложность в различении «четырех К» печально известна в отношении многих болезней мозга, особенно при исследовании посмертных образцов тканей. Пожалуйста, разъясните этот вопрос на примере сигнальных путей BDNF, снижения ГАМК-синтезирующего фермента GAD67, пре- и постсинаптических изменений. Расставьте «К» для иллюстрации того, как вы пытались сделать свой выбор.

DL: Что касается первой категории - причины, то в нашем случае я взял бы слово «причина» в большие кавычки. Для определения того, что приводит к потере рецепторов TrkB, нам нужно пройти еще выше по течению. С учетом этой оговорки, я бы сказал так - по моему мнению, снижение сигнальной активности TrkB (это причина) ведет к снижению синтеза GAD67 (это следствие). Изменения в уровнях пресинаптического парвальбумина, GAT1, и количестве постсинаптических альфа-2 субъединиц рецептора ГАМК(А) представляют третью «К» - компенсаторную реакцию. Мы исследовали людей, проверяли воздействие антипсихотиков на приматах, и можем сказать, что ни одна из этих находок не является побочным эффектом терапии.

SRF: Прекрасный пример. Говоря об общей ситуации, как современные методы исследований помогают ученым решать проблему «четырех К»?

DL: На эту тему есть пара мыслей. Во-первых, нужно понимать важность триангуляции. Для каждого нарушения важно собрать как можно больше независимых доказательств, подходящих к проблеме с разных углов и сходящихся на одной интерпретации – это усилит вашу позицию.

Для примера рассмотрим вопрос с побочными эффектами. В идеале мы хотели бы исследовать только тех людей, кто переживал свой первый эпизод шизофрении и никогда еще не принимал антипсихотические средства. Это невозможно. Так как же нам оценить возможный эффект лекарств? Один из способов – исследовать людей, которые не проходили терапию на момент смерти. Обнаруженное у обеих групп нарушение будет скорее являться последствием болезни, а не лечения. Ограничение этой тактики в том, что мы не знаем, как долго сохраняется эффект от приема лекарств. Есть еще способ – исследовать людей с другими заболеваниями, которые принимали те же лекарства. Если данного нарушения у них нет, это служит дополнительным свидетельством в пользу того, что нарушение вызывается не лекарствами, а болезнью. Третий вектор доказательства – изучение эффекта лекарств на обезьянах в дозах, копирующих их клиническое применение у человека. Если у этих обезьян данное нарушение не обнаружится, это также будет согласовываться с теорией. Нужно понимать, что это обезьяны, а не люди, и что они не больны. Таким образом, каждый эксперимент по отдельности имеет свой набор ограничений. Но если все они сходятся на одном результате, это дает большую уверенность в ваших выводах.

Во-вторых, необходимо сознавать, что каждый тип исследования ставит перед вами ограничения в выборе вопросов. Посмертные исследования мозга человека критически необходимы для ответов на определенные вопросы, уникально соответствуя нужным условиям. Но они не дадут ответа на вопросы других типов, и вам придется перейти к другим моделям, например к обезьянам, чей мозг наиболее близко повторяет схематику цепей коры человеческого мозга. Префронтальный кортекс у грызунов сильно отличается от кортекса приматов, и это представляет очевидные ограничения при их исследовании. Но возможность задать некоторые вопросы существует опять же только при исследованиях грызунов. Мы стараемся быть гибкими и использовать ту систему, которая лучше соответствует каждому конкретному вопросу.

SRF: Возвращаясь к предыдущему вопросу, каковы ваши находки в отношении нарушения возбудительных систем при шизофрении и в исследованиях с использованием микроматриц?

DL: По нашему мнению, имеются ясные доказательства нарушений глутаматергических систем и возбудительных функций префронтальной коры. Мы искали ответ на вопрос, существует ли некий подвид пирамидальных клеток, участвующий в определенных наиболее затронутых болезнью сетях. Наши данные на сегодняшний день позволяют предположить, что на пирамидальных клетках из 3 слоя коры, по сравнению с другими пирамидальными клетками, болезнь отражается сильнее. Мы продолжаем исследования по двум направлениям. Во-первых, мы пытаемся найти молекулярные маркеры данной предположительно более уязвимой популяции нейронов, что помогло бы в их изучении. Во-вторых, мы задаемся вопросом о том, существует ли некая особенность в образуемых этими нейронами связях – входящих либо исходящих – это помогло бы нам понять те функциональные нарушения, которые ожидаются в результате их морфологических изменений.

SRF: Получены ли вами уже ответы на эти вопросы? Например, о дендритных шипиках в 3 слое пирамидальных нейронов вами была недавно опубликована статья (Kolluri et al., 2005).

DL: Эта работа продолжила предыдущее исследование, в котором мы показали уменьшение количества дендритных шипиков – значительное в нижней части 3 слоя и менее выраженное в верхней части 3 слоя коры головного мозга больных (Glantz and Lewis, 2000). Последняя работа не показала подобного нарушения в 5 и 6 слоях у тех же самых больных, и эта негативная находка подтверждает идею о специфичности изменений по типу клеток либо по принадлежности к определенным сетям. В связи с этим мы недавно исследовали экспрессию у больных шизофренией некоторых генов, кодирующих протеины, важные для формирования и поддержания шипиков. (Hill et al., 2006; см новостную заметку SRF на эту тему). У нас появилась еще одна идея: раз пирамидальные клетки нижней части 3 слоя расположены в зоне входящих проекций медиодорсального таламуса, возможно, их изменения вызваны нарушениями в таламусе. На сегодня выводы исследований по этому вопросу разнятся. Есть работы, демонстрирующие нарушения функционирования данной части таламуса, как и работы по визуализации, показывающие уменьшение размеров этой части. В вопросе о количестве клеток в медиодорсальном таламусе на данный момент существует раскол. Одинаковое число публикаций говорит либо об уменьшении количества клеток, либо об их нормальном количестве, к последним принадлежит и наша работа (Dorph-Petersen et al., 2004). Это касается количества нейронов; эфферентные проекции этих нейронов все-таки могут быть нарушены, но расследовать этот вопрос уже труднее. И мы ищем альтернативные пути рассмотрения функциональной целостности таламусных входов в префронтальный кортекс.

SRF: Так как же изменяются приходящие из таламуса соединения в период развития мозга и в пубертатный период? Каково влияние синаптического прунинга, в особенности у детей, которым только предстоит заболеть шизофренией? Лет через 30, при посмертном исследовании, подобные детали легко проглядеть; если к тому времени число нейронов немного снизится, трудно понять значение этой находки.

DL: Я согласен. Сильной стороной посмертных исследований человека является то, что это единственный способ взглянуть на молекулярные, клеточные, и сетевые нарушения при шизофрении. Но жизнь больного человека можно сравнить с эпическим кинополотном, а мы рассматриваем лишь один кадр, да и то скомканный. Вот где проявляется важность разноплановых исследований.

SRF: Что известно о том, есть ли при шизофрении разница в осуществлении прунинга синапсов пирамидальных нейронов префронтальной коры? Теряют ли больные шизофренией дети в этой зоне мозга большее количество синапсов?

DL: Выводы различных исследований сходятся на том, что число возбудительных входящих соединений в этой популяции пирамидальных клеток снижено. Остается открытым вопрос, происходит ли это в силу чрезмерного прунинга или прунинг лишь усугубляет нарушения, вызванные неправильным формированием этих синапсов, то есть синапсов может быть изначально сформировано меньше, а прунинг еще больше сокращает их количество.

SRF: Предположительно, клетки-канделябры при образовании синапсов не способны соревноваться за выживание с более скоординированными и крепкими нейронами, не имеющими ГАМКергических нарушений. Неужели все ваши находки, касающиеся нарушений в клетках-канделябрах, не поддерживают идею о том, что они подвержены усиленному прунингу из-за своих более слабых разрядов?

DL: Позвольте мне упомянуть о двух идеях, которые нас заинтересовали. Во-первых, интересна возможная связь ГАМКергических нарушений с нарушениями возбудительных соединений. Несколько находок в области базового функционирования мозга подтверждают эту гипотезу. Например, работа Такао Хенш (Takao Hensch) из института RIKEN, исследовавшего развитие окулярного доминирования в зрительной коре, показала, что ГАМК необходима для наступления критического периода, в котором происходит формирование возбудительных входов, позволяющих одному глазу доминировать над другим в данной колонке коры. Он также показал, что нарушение этих ГАМКергических функций изменяет плотность шипиков. Экстраполировать эти выводы на префронтальный кортекс – дерзкий шаг. Но у нас, по крайней мере, появляется некая концепция, посредством которой мы можем предложить механизм того, как недостаток GAD67, если он возникает в раннем возрасте, приводит в том числе и к нарушениям входящих возбудительных сигналов. Интересно отметить то, что по крайней мере одна группа исследователей сообщила об ассоциации аллельной вариации гена GAD67 с шизофренией (DeLuca et al., 2004).

SRF: То есть, нарушения активности воздействуют на процесс прунинга?

DL: Да. Альтернативный взгляд – не обязательно исключающий предыдущее объяснение – возник в результате наших исследований с использованием генных матриц. Одним из наших первоначальных наблюдений, описанных в первой работе Кароя Мирникс (Mirnics et al., 2000) стала недостаточность мРНК транскриптов тех генов, которые кодируют протеины, участвующие в процессах пресинаптического высвобождения нейромедиаторов. Если эти отклонения в экспрессии генов отражают ранний процесс, то человек еще до развития болезни будет иметь нарушения синаптических функций. Избыточное количество синапсов, характерное для детей, может компенсировать это снижение функционирования, но при достижении пубертатного периода прунинг запустит два процесса. Во-первых, вы потеряете эту способность к компенсации, во-вторых, синапсы с нарушенными функциями подвергнутся избыточному прунингу. Мы оформили эти мысли в виде гипотезы – она показалась нам достаточно интересной, но представляла собой экстраполяцию существовавших данных (Mirnics et al., 2001). Мы думаем, что на механистическом уровне гипотеза дает объяснение отклонениям в прунинге и появлению клинического синдрома по завершении пубертатного периода, а также не вполне нормальной работе мозга до наступления пубертатного периода. Последнее относится к когнитивной функции, и это нарушение представляется одной из черт шизофрении. Когнитивные нарушения могут наблюдаться у детей с самого раннего возраста, за долгие годы до клинической манифестации болезни.

SRF: Карой Митникс и вы стали пионерами, использовав генные микрочипы в исследованиях шизофрении. Дебют этой технологии сопровождался большими надеждами, но с тех пор наступило некоторое разочарование из-за проблем с качеством образцов, проверкой и интерпретацией результатов. Каков ваш сегодняшний взгляд на это? Насколько богатым был улов для вашей лаборатории? Был ли в этом смысл?

DL: Несомненно был, но нам следует понимать две вещи. Во-первых, уровень анализа нужно повышать и повышать. В начальных исследованиях мы измельчали все серое вещество коры мозга и пытались выделить сигнал, используя платформы с ограниченной чувствительностью. Сейчас используются более целенаправленные техники выделения ткани, будь то отдельный слой коры или гомогенная популяция клеток, а обработка происходит на платформах с большей чувствительностью - все для улучшения сигнала. Этот прогресс в области микромассивов несомненно повысил качество находок; теперь у нас больше возможностей для их интерпретации и проверки.

Во-вторых, с самого начала нам были ясны ограничения технологии, но в радостной шумихе о них забывали упомянуть. Дело в том, что техника помогает обнаружить тканевые уровни транскрипции, но не говорит ничего ни о причине нарушений, ни об их последствиях для сигнальных сетей. И каждое исследование с использованием микромассивов должно рассматриваться в таком контексте.

В нашем случае находкой стала недостаточная генетическая экспрессия регулятора передачи сигнала G-белка-4 (regulator of G-protein signaling 4, RGS4). Микрочипы выдали этот результат без предварительных гипотез с нашей стороны. Что интересно, локус данного гена ранее показал сильную ассоциацию с шизофренией в исследованиях Линды Бржустович (Linda Brzustowicz et al., 2000), а кодируемый им протеин играет очень интересную роль в нейротрансмиттерных путях, предположительно связанных с шизофренией. Так уже имевшиеся данные были пополнены находками, полученными с использованием микрочипов, и это позволило предположить связь данного гена с заболеванием. Действительно, в исследованиях Виша Нимгаонкара (Vish Nimgaonkar) и в работах наших коллег в Питсбурге, а также в работах других групп было показано, что RGS4 является потенциальным фактором риска развития шизофрении. Однако, как и в случае с другими генами-кандидатами, существуют проблемы в интерпретации различных гаплотипов, обнаружении патогенных однонуклеотидных полиморфизмов и так далее (Talkowski et al., 2006). В любом случае, вот вам иллюстрация того улова, который могут принести такие методы. Улов ценный и разнообразный, и в числе рыбешек могут оказаться гены-кандидаты.

SRF: В заключительной части хотелось бы получить обзор вашей трансляционной программы. Последняя часть вашего сайта посвящена терапевтическому вмешательству. Там же вы описываете небольшое клиническое исследование. Какое средство вы испытывали?

DL: Идея заключается в том, что ГАМКергические отклонения в префронтальном кортексе приводят к снижению осцилляций в гамма диапазоне, и в результате нарушается рабочая память. Поэтому клиническое испытание должно ответить на вопрос – сможем ли мы усилить ГАМКергические сигналы в начальном сегменте аксона пирамидальной клетки таким образом, чтобы сохранить координацию входного сигнала по времени? Точность во времени важна. Нам нужно разработать такой подход, который не просто участит разряды клеток-канделябров, и не приведет к общему усилению ГАМКергической передачи сигналов. И то, и другое принесет больше вреда, чем пользы. Мы искали молекулу, выборочно воздействующую на ГАМК(А) рецепторы, содержащие субъединицу альфа-2. Нам хотелось, чтобы это был позитивный аллостерический модулятор – средство, усиливающее поток ионов хлора сквозь рецептор только в присутствии ГАМК. Идея в том, чтобы усиливать сигнал клеток-канделябров только при их естественном разряде. Связавшись с фармацевтической компанией, мы выбрали уже существующее средство и в настоящее время проводим двойное слепое, плацебо-контролируемое рандомизированное исследование. На выходе мы получим глобальную оценку когнитивного функционирования пациентов, а также специфические данные по гамма-активности во время выполнения задач, задействующих функции префронтального кортекса. Если нам удастся найти пресловутую фармацевтическую серебряную пулю, результатом будет глобальное улучшение когнитивной функции, отражающееся на повседневной жизни пациентов. Думаю, что более вероятным результатом станет свидетельство того, что этот состав улучшает префронтальную физиологию неким образом, согласующимся с улучшением когнитивной функции. Окажется ли эта конкретная молекула полезной в клиническом применении, в настоящий момент неизвестно.

SRF: …значит эта молекула не принадлежит к числу существующих ныне лекарств.

DL: Правильно.

SRF: Это экспериментальное средство. Оно относится к бензодиазепинам? Я думала, что уже существуют бензодиазепины, воздействующие на рецепторы ГАМК(А).

DL: Верно. Ограничением применяемых сегодня бензодиазепинов является то, что они воздействуют на рецепторы ГАМК(А), содержащие субъединицы альфа-1, альфа-2, альфа-3 или альфа-5. К примеру, нам ясно, что активность бензодиазепинов в отношении субъединицы альфа-1 обуславливает их седативное воздействие, а это не слишком хорошо для когнитивной сферы. Опять же, активность по отношению к альфа-5 субъединице ухудшает функционирование гиппокампа, что тоже снижает когнитивные способности. Так что если доступные на сегодня бензодиазепины и способны принести некоторую пользу в терапии шизофрении, их отрицательные когнитивные эффекты перевешивают эту пользу.

SRF: В настоящее время несколько фармацевтических компаний заняты разработкой многочисленных агонистов ГАМК(А) рецепторов, но в большинстве случаев их целью является терапия эпилепсии, а не шизофрении. И мало кто думал о субъединице альфа-2 в качестве мишени воздействия. Этот так?

DL: Да.

SRF: Что находится выше по течению от рецептора TrkB?

DL: Мы пока не знаем. Одной из известных нам черт TrkB является то, что его экспрессия зависит от активности организма. Поэтому один из сценариев предполагает, что ближе к истокам находится такой фактор, как гипофункция NMDA-рецепторов. На данный момент это самая жизнеспособная гипотеза, и мы пытаемся осуществить ее проверку.

SRF: Так почему бы не пойти вверх по течению и не разработать агонисты TrkB?

DL: Эта идея не вызвала у нас особого восторга по двум причинам. Мы думаем, что истинным источником нарушений является недостаточная экспрессия рецепторов TrkB. Если рецепторов не хватает, возможно ли любой концентрацией лигандов повысить их сигнал до нормального уровня? Такой подход был бы более уместен при критически нарушенном производстве BDNF и нормальном состоянии рецепторов TrkB. Другой причиной отказа было наше желание сосредоточить терапевтическое воздействие на локальном физиологическом нарушении, чтобы атаковать критический участок и не наносить удара по своим, говоря военным языком.

SRF: Касаясь этого вопроса – потерян сигнал или потеряны рецепторы – я хотела бы обсудить мышиные модели. Если я правильно поняла, вы изучали мышей со сниженной экспрессией TrkB, полученных в лаборатории Луиса Рейхардта (Louis Reichardt), а также мышей с индуцируемым удалением гена BDNF (inducible knockout) из лаборатории Лизы Монтеджиа (Lisa Monteggia) и Эрика Нестлера (Eric Nestler), и обнаружили очень интересные, различающиеся эффекты этих мутаций.

DL: Мы замеряли те же характеристики, что и при посмертных исследованиях человеческого мозга. В частности, уровни транскрипции GAD67 и парвальбумина. Мы также пополнили этот список другими маркерами – результаты их замеров еще не опубликованы. Мы не смогли обнаружить разницу в транскрипции обоих маркеров как у эмбриональных, так и у взрослых BDNF-нокаутных мышей. Но у мышей с гипоморфным геном TrkB транскрипция обоих маркеров была снижена в дозо-зависимой манере – гомозиготные мыши с недостатком TrkB демонстрировали большую по сравнению с гетерозиготными мышами потерю экспрессии GAD67 и парвальбумина. И, на клеточном уровне, дефицит транскрипции GAD67 в точности повторял картину, наблюдаемую нами при шизофрении. То есть, в одной подгруппе ГАМКергических нейронов транскрипция была ниже доступного нам уровня детекции, но остальные ГАМКергические нейроны демонстрировали нормальную экспрессию GAD67.

SRF: Значит ли это, что Рейхардт непреднамеренно создал частичную мышиную модель шизофрении?

DL: Когда речь заходит о моделировании шизофрении на животных, я предпочитаю высказываться осторожно. В данной мыши воплощен отдельный компонент болезни: одна причина (снижение экспрессии TrkB) и ее следствие (падение уровней GAD67 и парвальбумина). Я не могу на данный момент сказать, распространяется ли сходство модели с болезнью за пределы этих отклонений. В настоящее время мы разводим этих мышей и намерены определить, есть ли у них отклонения гамма-осцилляций.

SRF: Я собиралась спросить о нарушениях рабочей памяти у этих мышей – есть ли они, или такие измерения в принципе невозможно провести на мышах?

DL: По всеобщему убеждению, мыши не отличаются умом и сообразительностью. Некоторые исследователи задаются вопросом – а насколько серьезно в принципе можно исследовать рабочую память у мышей? Но гамма-активность можно изучать не только в контексте поведенческих задач. Для начала мы собираемся узнать, не лишены ли мутантные мыши тех механизмов, которые позволяют здоровым мышам генерировать гамма-активность в определенных условиях.

SRF: В более широкой перспективе – существуют ли вообще практичные мышиные модели, на которых продублированы хотя бы отдельные аспекты шизофрении? Прогресс в исследованиях болезни Альцгеймера особенно ускорился после появления мышиных моделей, хотя эти модели также были частичными. Теперь чуть ли не каждый месяц появляется новая модель.

DL: Ключевой особенностью болезни Альцгеймера является то, что ее исследователям уже были доступны специфические молекулярные и нейропатологические механизмы; они не были вынуждены полагаться лишь на клинический исход заболевания. Я думаю, что мы продвигаемся в том же направлении, и мышиные модели станут незаменимыми инструментами в раскрытии механизмов болезни. Но мы все еще на ранней стадии. Я склонен полагать, что мыши докажут свою полезность в распутывании отношений между молекулярными нарушениями и физиологическими показателями, и - пожалуй, в меньшей степени - помогут в изучении поведения.

SRF: Действительно, поведение при шизофрении гораздо сложнее поведения при болезни Альцгеймера. Однако скептики поначалу были и там – как можно, говорили они, определить деменцию у мыши, если мышь изначально не очень умна. Ваша работа шла по нескольким направлениям, и я хочу оставить у читателя общее представление о ней. Попытаюсь вкратце повторить основные пункты нашей беседы. Несколько параллельных исследований сошлись на том, что сниженная нейротрофинная активность рецепторов TrkB в канделяберных нейронах приводит к снижению экспрессии GAD67, то есть к падению уровня ГАМК в парвальбуминовых клетках-канделябрах префронтальной коры. Пресинаптическая экспрессия GAT1 в картриджах клеток-канделябров снижается; экспрессия субъединицы альфа-2 рецептора ГАМК(А) на начальных сегментах аксонов пирамидальных клеток возрастает в попытке наиболее полно использовать оставшуюся ГАМК. Но этой компенсаторной реакции недостаточно, и в итоге нарушается тормозная нейропередача, синхронизирующая исходящую активность пирамидальных нейронов третьего слоя, проекции которых ведут к другим областям ассоциативной коры. Как следствие, сбивается синхронность разрядов нейросетей, образуемых этими клетками. В свою очередь, это ведет к ослаблению осцилляций в гамма-диапазоне во время выполнения задач на рабочую память, что и отмечается у больных шизофренией. Вы также полагаете, что синаптический прунинг и заметное уменьшение количества ГАМКергических соединений демаскируют в данных системах развившиеся в ранние годы нарушения. Я все сильно упростила, и вы поспешите добавить, что это лишь часть картины болезни – но в целом это изложение передает суть ваших находок на данный момент?

DL: Да. Вам прекрасно удалось выразить в нескольких словах мою пространную речь. Я лишь добавлю, что стратегия, предполагающая разделение процесса болезни на отдельные механизмы, может доказать свою ценность только в одном случае – если эта стратегия поможет нам выбрать оптимальные молекулярные мишени для новых лекарств и оптимальным образом сконфигурировать данные лекарства.

SRF: Спасибо, что уделили нам время.

DL: Я провел его с удовольствием.